Rantaian Pengklonan Tikus Berakhir Selepas 58 Generasi apabila Perubahan DNA Berbahaya Terkumpul

Eksperimen 20 Tahun Mencapai Penghujungnya

Selepas 30,947 percubaan pemindahan nukleus dan lebih 1,200 ekor tikus yang diklon daripada seekor betina, pasukan penyelidik Jepun menamatkan eksperimen yang berlangsung kira-kira 20 tahun. Kelima-lima ekor tikus yang dilahirkan pada generasi ke-58 mati pada hari berikutnya, sekali gus menamatkan rantaian yang pernah disangka penyelidik mungkin berterusan tanpa had.

Eksperimen yang dijalankan dari 2005 hingga 2025 itu mendapati pengklonan berulang menyebabkan perubahan berbahaya terkumpul dalam DNA. Kejayaan kelahiran pada mulanya meningkat, daripada kira-kira 7% pada generasi pertama kepada 15.5% pada generasi ke-26. Kadar itu mula menurun pada generasi ke-27 dan akhirnya mencapai 0.6%, kira-kira enam kelahiran bagi setiap 1,000 embrio klon yang dipindahkan ke dalam induk tumpang.

Penemuan ini diterbitkan dalam Limitations of serial cloning dalam Nature Communications. Universiti Yamanashi menamakan Profesor Madya Sayaka Wakayama dan Profesor Teruhiko Wakayama, pengarah Pusat Bioteknologi Lanjutan universiti itu, sebagai antara penyelidik dalam pengumuman penyelidikan tersebut.

Hasil yang paling mendedahkan ialah perbezaan antara penampilan dengan keupayaan membiak. Banyak tikus dalam rantaian itu kelihatan sihat dan hidup kira-kira dua tahun, namun generasi seterusnya semakin sukar dibiakkan, sama ada melalui pengklonan atau pembiakan biasa.

Teruhiko Wakayama, perintis pengklonan tikus di Universiti Yamanashi, menggambarkan persoalan di sebalik eksperimen itu melalui perbandingan yang mudah difahami:

Menyalin gambar menggunakan mesin fotokopi menghasilkan imej yang sedikit lebih rendah kualitinya. Menyalin salinan itu sekali lagi menjadikan kualitinya lebih teruk,

Bagi tikus tersebut, perubahan melibatkan huruf DNA individu serta bahagian kromosom yang jauh lebih besar. Kajian itu mengaitkan pengumpulan perubahan tersebut dengan kemerosotan kejayaan kelahiran pada akhirnya.

Bagaimana Penyelidik Mengklon Klon

Pasukan itu menggunakan pemindahan nukleus sel somatik. Sel somatik ialah sel badan, bukannya ovum atau sperma. Penyelidik mengeluarkan nukleus, yang mengandungi kebanyakan arahan genetik sel, lalu memindahkannya ke dalam ovum yang belum disenyawakan dan nukleusnya telah dibuang.

Ovum itu kemudiannya perlu menetapkan semula arahan tersebut supaya nukleus daripada sel badan dewasa dapat mengawal perkembangan embrio. Penyelidik memindahkan embrio yang terhasil ke dalam induk tumpang dan menggunakan sel daripada klon yang hidup untuk menghasilkan generasi seterusnya.

Sel penderma berasal daripada sel kumulus, yang mengelilingi dan menyokong ovum. Penderma asal ialah seekor tikus betina berbulu agouti, iaitu warna yang terhasil daripada jalur pigmen pada setiap helai bulu. Semua tikus klon ialah betina dan mempunyai warna bulu yang sama.

Penyelidik menghasilkan kira-kira tiga hingga empat generasi setahun. Mereka tidak menghasilkan setiap tikus terus daripada sel penderma asal yang disimpan, sebaliknya berulang kali meneruskan keturunan itu melalui haiwan klon yang baharu. Reka bentuk tersebut membolehkan mereka menjejaki perubahan yang diwariskan dari satu generasi ke generasi seterusnya.

Mengapa Hasil Awal Kelihatan Memberangsangkan

Pengumuman RIKEN pada Mac 2013 menggambarkan eksperimen yang masih menunjukkan perkembangan memberangsangkan. Pasukan itu telah menghasilkan 581 ekor tikus merentasi 25 generasi ketika makalah tersebut dikemukakan, dan 598 ekor merentasi 26 generasi ketika pengumuman dibuat.

Penyelidik menggunakan trichostatin A, atau TSA, ubat yang membantu nukleus yang dipindahkan menetapkan semula aktiviti gennya. Percubaan terdahulu untuk mengklon tikus berulang kali hanya mencapai kira-kira enam generasi. Dengan TSA dan keadaan eksperimen yang lebih baik, kejayaan kelahiran meningkat dan bukannya terus merosot.

Ukuran kesihatan, kesuburan, jangka hayat dan hujung kromosom juga kelihatan meyakinkan pada peringkat itu. Oleh itu, penyelidik percaya proses tersebut mungkin berterusan tanpa had. Penjejakan keturunan yang sama selama sedekad lagi mendedahkan masalah yang tidak kelihatan dalam 25 generasi pertama.

Pencapaian utama menunjukkan bagaimana kesimpulan kajian itu berubah:

• 2005: Pengklonan bersiri bermula. Makalah akhir menetapkan permulaannya pada Januari, manakala laporan RIKEN pada 2013 menyatakan ia bermula pada penghujung tahun.
• 8 Mac 2013: RIKEN mengumumkan 598 ekor tikus merentasi 26 generasi, dengan kejayaan kelahiran mencapai kira-kira 15%.
• Generasi ke-27 dan seterusnya: Kejayaan kelahiran mula merosot secara berterusan, meskipun terdapat variasi antara generasi.
• 2025: Eksperimen berakhir pada generasi ke-58 selepas kesemua lima ekor tikus yang lahir pada generasi itu mati pada hari berikutnya.

Apakah Perubahan yang Berlaku dalam DNA?

Penyusunan jujukan genom mendedahkan kira-kira 3,700 varian nukleotida tunggal dan 80 sisipan atau penghapusan kecil antara generasi pertama dengan generasi ke-57. Varian nukleotida tunggal, atau SNV, ialah perubahan pada satu huruf dalam jujukan DNA. Sisipan atau penghapusan pula menambah atau membuang bahagian kecil jujukan tersebut.

Makalah itu mengira purata 69.4 SNV dan 1.4 sisipan atau penghapusan kecil bagi setiap generasi. Banyak perubahan DNA tidak memberi kesan besar, tetapi sesetengahnya mengganggu arahan yang diperlukan untuk perkembangan atau pembiakan normal.

Sebagai perbandingan, penyelidik meneliti dua jalur tikus yang dikekalkan melalui pembiakan sesama adik-beradik selama 60 generasi dalam kira-kira 20 tahun. Jalur tersebut mengumpulkan purata 22.3 SNV bagi setiap generasi. Oleh itu, kadar dalam jalur pengklonan adalah kira-kira 3.1 kali lebih tinggi, berdasarkan perbandingan 69.4 dengan 22.3.

Peratusan varian kecil yang diramalkan mengganggu atau mengubah protein juga meningkat. Kadarnya naik daripada 0.52% bagi perubahan yang muncul antara generasi pertama hingga ke-23 kepada 1.19% bagi perubahan yang muncul antara generasi ke-23 hingga ke-57.

Penyelidik turut membina semula salasilah tikus berdasarkan DNA mereka. Salasilah itu sepadan dengan rekod keturunan eksperimen, sekali gus mengesahkan bahawa seluruh rantaian itu kekal berasal daripada penderma asal sepanjang eksperimen.

Perubahan Kromosom Lebih Besar Menambah Beban

Tikus tersebut mengumpulkan lebih daripada perubahan pada huruf DNA individu. Penyusunan jujukan mengenal pasti kira-kira 80 hingga 84 varian struktur baharu, iaitu perubahan lebih besar pada susunan atau jumlah DNA, antara generasi pertama dengan generasi ke-57.

Enam belas varian besar melibatkan bahagian yang sekurang-kurangnya sepanjang 40,000 huruf DNA. Antara perubahan yang ditemukan ialah kehilangan satu kromosom X, perubahan besar pada kromosom empat dan pertukaran bahan antara kromosom tujuh dengan sembilan.

Menjelang generasi ke-57, penyelidik menganggarkan kira-kira 30 mutasi menyebabkan kehilangan fungsi gen dan kira-kira 50 mengubah arahan protein yang dikodkan oleh gen, sebelum mengambil kira kehilangan satu kromosom X. Dua penghapusan besar turut menjejaskan rantau yang sama dan menghapuskan fungsi kedua-dua salinan gen bernama Csmd1.

Penulis mengaitkan kemerosotan kadar kelahiran dengan beban mutasi secara keseluruhan. Menurut penjelasan mereka, perubahan tambahan yang merosakkan pada penghujung eksperimen menyebabkan genom yang sudah banyak berubah melampaui tahap yang dapat ditoleransi oleh tikus yang sedang berkembang.

Punca kadar mutasi yang lebih tinggi masih belum diketahui. Pemindahan nukleus sel badan berulang kali mungkin menyumbang, dan sel badan boleh mengumpulkan mutasi sepanjang hayat haiwan. Ketiadaan pembiakan seksual biasa juga mengubah cara mutasi itu diwariskan merentas generasi.

Mengapa Penetapan Semula Aktiviti Gen Tidak Mencukupi

Pengklonan memerlukan lebih daripada memindahkan DNA ke dalam ovum. Ovum itu juga perlu menetapkan semula tanda kimia yang membantu menentukan gen mana yang aktif. Tanda ini disebut epigenetik kerana ia mengawal penggunaan DNA tanpa mengubah jujukannya.

Penyelidik sebelum ini mengesyaki kegagalan proses penetapan semula itu mungkin bertambah buruk pada setiap pusingan pengklonan. Namun, ukuran mereka menunjukkan bahawa pengumpulan mutasi DNA merupakan penjelasan utama bagi kemerosotan yang berlaku kemudian.

Tikus klon mempunyai plasenta yang membesar, ciri yang diketahui dalam pengklonan tikus. Sepanjang eksperimen, berat plasenta purata kira-kira 0.30 gram, berbanding 0.11 gram dalam kumpulan kawalan yang dihasilkan melalui persenyawaan in vitro. Namun, beratnya tidak terus meningkat dari satu generasi ke generasi berikutnya.

Ujian terhadap beberapa tanda epigenetik dalam embrio awal turut menunjukkan corak yang secara umumnya serupa antara klon baharu dengan klon generasi ke-51. TSA terus membantu: kejayaan kelahiran generasi ke-51 ialah 5.4% dengan rawatan, berbanding 1.6% tanpa rawatan.

Telomer, iaitu jujukan DNA pelindung pada hujung kromosom, menawarkan satu lagi kemungkinan penjelasan. Analisis penyusunan jujukan pada peringkat kemudian mendapati sedikit bukti bahawa telomer memendek dengan ketara merentasi generasi yang dikaji. Secara keseluruhan, ujian itu mengarahkan perhatian kepada beban perubahan yang semakin meningkat pada jujukan DNA dan struktur kromosom.

Tikus yang Kelihatan Sihat Melahirkan Lebih Sedikit Anak

Pembiakan biasa mendedahkan kemerosotan reproduktif yang sukar dikesan melalui penampilan tikus. Tikus betina generasi ke-20 melahirkan purata 9.9 anak bagi setiap kelahiran apabila dikacukkan dengan tikus jantan biasa, hampir sama dengan 10.3 yang direkodkan dalam kumpulan kawalan.

Purata bilangan anak kemudian menurun kepada 2.8 pada generasi ke-50 dan 2.2 pada generasi ke-55. Angka terakhir itu kira-kira 79% lebih rendah daripada purata kumpulan kawalan, berdasarkan perbandingan 2.2 dengan 10.3 anak.

Bilangan ovum yang dikumpulkan selepas rangsangan hormon tidak menurun apabila generasi pengklonan bertambah. Oleh itu, penyelidik meneliti apa yang berlaku kepada ovum selepas pengaktifan atau persenyawaan.

Apabila ovum disenyawakan di makmal menggunakan sperma daripada tikus jantan biasa, 97.6% embrio kawalan mencapai peringkat blastosista, iaitu peringkat awal sebelum implantasi. Kadarnya ialah 39.7% bagi ovum daripada klon generasi ke-25 dan 20.3% bagi ovum daripada klon generasi ke-53.

Eksperimen menggunakan ovum generasi ke-56 mendapati masalah pada kedua-dua nukleus dan sitoplasma, iaitu bahan yang mengelilingi nukleus. Penggantian salah satu komponen dengan komponen sepadan daripada ovum kawalan tetap menghasilkan kadar perkembangan yang sangat rendah. Kedua-dua bahagian ovum itu kelihatan terjejas.

Pembiakan Seksual Memulihkan Sebahagian Kesuburan

Sesetengah anak daripada klon generasi kemudian hidup dan membiak dengan lebih berjaya. Walaupun tikus betina klon generasi ke-55 melahirkan purata 2.2 anak, anak-anak mereka kemudian menghasilkan purata 7.0 anak setiap kelahiran, lebih tiga kali ganda.

Saiz plasenta pada cucu-cucu ini juga hampir sama dengan plasenta daripada embrio yang dihasilkan melalui persenyawaan, bukannya plasenta membesar yang lazim bagi tikus klon.

Pembiakan seksual menyusun semula bahan genetik ketika ovum dan sperma terbentuk, kemudian menggabungkannya dengan DNA daripada induk lain ketika persenyawaan. Salinan gen berfungsi daripada satu induk kadangkala boleh menggantikan salinan rosak daripada induk yang satu lagi. Embrio yang mengalami masalah genetik teruk mungkin berhenti berkembang, manakala embrio dengan gabungan yang masih berfungsi dapat hidup.

Keturunan itu tetap mewarisi mutasi daripada tikus betina klon. Penyusunan jujukan genom menemukan varian pada anak dan cucu, termasuk pertukaran antara kromosom tujuh dengan sembilan. Penyelidik mencadangkan bahawa kedua-dua kromosom yang berubah itu diwarisi bersama, sekali gus mengekalkan pertukaran tersebut dalam keadaan seimbang.

Peningkatan saiz kelahiran itu menunjukkan pemulihan sebahagian keupayaan membiak melalui pembiakan seksual. Keturunan tersebut dapat membiak dengan lebih baik sambil terus membawa sebahagian perubahan genetik yang terkumpul semasa pengklonan.

Implikasi terhadap Pemuliharaan dan Penternakan

Pengklonan menarik minat ahli pemuliharaan kerana sel yang disimpan boleh mengekalkan bahan genetik daripada haiwan yang telah mati atau tidak dapat membiak. Dalam penternakan, pengklonan menawarkan cara untuk menghasilkan semula haiwan yang mempunyai ciri bernilai. Eksperimen ini menunjukkan mengapa penggunaan sedemikian memerlukan perhatian terhadap keadaan DNA penderma dan kesihatan reproduktif keturunannya.

Penemuan ini berkaitan dengan pengklonan berulang melalui rantaian panjang penderma yang silih berganti. Lima puluh lapan generasi ialah had bagi keturunan tikus khusus ini dalam keadaan eksperimen tersebut; bilangan generasi yang mungkin dicapai oleh keturunan lain atau spesies mamalia lain masih belum diketahui.

Katarzyna Malin, ahli endokrinologi perkembangan di Universiti California, Davis, yang tidak terlibat dalam penyelidikan ini, berkata penemuan tersebut menyokong usaha pemuliharaan yang menghalang spesies daripada mencapai tahap krisis, berbanding bergantung pada pengklonan untuk menyelamatkannya selepas itu.

Ben Novak daripada organisasi pemuliharaan Revive & Restore menekankan kepentingan mutasi yang terkumpul dalam tisu badan sepanjang hayat haiwan. Sel penderma membawa sejarah perubahan DNAnya sendiri, dan hal ini penting apabila sel tersebut menjadi titik permulaan bagi haiwan lain.

Kajian itu menghimpunkan dua pengajaran praktikal. Pengklonan boleh mengekalkan akses kepada bahan genetik haiwan selama banyak generasi, namun usaha memastikan keturunan kekal sihat turut bergantung pada perubahan yang berlaku kepada DNA dari semasa ke semasa. Dalam eksperimen ini, pembiakan biasa membolehkan sesetengah keturunan memulihkan kesuburan selepas rantaian pengklonan menghampiri penghujungnya.

Perkara Utama

• Penyelidik menjalankan 30,947 percubaan pemindahan nukleus dan menghasilkan lebih 1,200 ekor tikus daripada seekor betina asal melalui pengklonan berturutan.
• Kejayaan kelahiran mencapai kemuncak 15.5% pada generasi ke-26, kemudian merosot kepada 0.6% menjelang penghujung eksperimen.
• Kelima-lima tikus generasi ke-58 mati sehari selepas dilahirkan, sekali gus menamatkan rantaian itu pada 2025.
• Jalur pengklonan mengumpulkan kira-kira tiga kali lebih banyak perubahan pada huruf DNA tunggal bagi setiap generasi berbanding jalur perbandingan yang dikekalkan melalui pembiakan sesama adik-beradik.
• Mutasi DNA berbahaya dan perubahan besar pada kromosom terkumpul, sementara keabnormalan epigenetik yang diukur tidak bertambah buruk secara beransur-ansur.
• Pembiakan seksual meningkatkan kesuburan sesetengah keturunan, walaupun mutasi yang diwarisi kekal.